Pośrednia detekcja – dlaczego jest potrzebna?
Wiele pestycydów ma budowę chemiczną, która nie umożliwia emisji światła fluorescencyjnego lub emituje go bardzo słabo. Przykłady to niektóre fungicydy i insektycydy zawierające ugrupowania halogenowe. Bezpośrednie wykrycie tych związków przy użyciu spektroskopii fluorescencyjnej jest trudne lub niemożliwe. W takich przypadkach stosuje się pośrednią detekcję: używa się niezależnego barwnika fluorescencyjnego, zwanego sensorem, który reaguje na obecność pestycydu.
Pośrednia metoda typu turn-off jest zatem potrzebna szczególnie dla substancji niefluorescencyjnych lub dla tych, których fluorescencja jest słaba lub maskowana w warunkach polowych. Zamiast mierzyć fluorescencję pestycydu, obserwujemy, jak pestycyd wygasza sygnał fluorescencyjny sensora. Dzięki temu możliwe jest pośrednie wykrycie obecności analizowanej substancji.
Badane barwniki fluorescencyjne
Przeanalizowaliśmy kilka potencjalnych barwników. Kluczowym okazała się kumaryna 7 (7-(dietyloamino)-3-(2-benzimidazolilo)kumaryna), wybrana ze względu na korzystne własności:
- Silne wzmocnienie absorpcji przy 355 nm oraz duży współczynnik ekstynkcji.
- Znaczne przesunięcie Stokesa, co zapewnia dobry rozdział pomiędzy maksimami absorpcji i emisji.
- Dobra rozpuszczalność i stabilność w środowisku wodnym – niezbędna do pomiarów in-situ w sadzie.
Wstępne kryteria doboru sensora obejmowały:
- Stabilność fluorescencji w wodzie,
- Wysoka intensywność sygnału i dobry rozdział spektralny względem absorpcji pestycydu,
- Chemiczna obojętność sensora w obecności analizowanych interferentów.
Kumaryna 7 spełniła te wymagania, dając wyraźny spadek fluorescencji w obecności wybranych pestycydów.
Optymalizowane parametry pomiaru
W eksperymentach systematycznie badano różne czynniki, aby zoptymalizować czułość detekcji:
- Stężenie pestycydu: Mierzono spadek fluorescencji przy różnych dawkach, tworząc krzywe kalibracyjne i określając czułość metody.
- Czas pomiaru: Sprawdzono, jak szybko następuje wygaszanie fluorescencji. Krzywe zależności w czasie pozwoliły wybrać optymalny moment odczytu (zwykle po kilku-kilkunastu minutach).
- Rodzaj rozpuszczalnika: Detekcję prowadzono głównie w wodzie. Porównywano wpływ pH i zawartości soli organicznych, co ma znaczenie przy zastosowaniu w warunkach polowych.
- Temperatura i środowisko: Badano stabilność sygnału w różnych temperaturach, ponieważ pomiar in-situ w sadzie odbywa się przy zmiennych warunkach.
Wszystkie powyższe parametry oceniano przy pomocy standardowych technik spektrofluorymetrycznych. Ostatecznie uzyskano zestaw kalibracyjny dla każdego badanego pestycydu, co umożliwiło wyznaczenie stałych wygaszania i zakresu liniowego detekcji.
